FLOW CYTOMETRY adalah metode analisis sel tunggal yang melibatkan karakteristik fisik suatu sel. Dalam sebuah FLOW CYTOMETER, populasi sel disuspensi dalam larutan garam jernih. Suspensi kemudian dialirkan melalui nozzle yang membentuk stream sel tunggal. Populasi sel lalu mengalir melalui sumber cahaya laser yang berbeda-beda, satu per satu. Sementara sedang diinterogasi oleh laser, sel memantulkan sinar (1). Gambar 1 berikut memberikan gambaran skematis FLOW CYTOMETER.
Gambar 1. Skematik optics FLOW CYTOMETER (2).
Rasio antara ukuran sel dan panjang gelombang laser mengubah perilaku scatter. Ketika ukuran sel lebih kecil dari pengarahan laser, perilaku scatter tidak konsisten dan intensitas rendah. Oleh karena itu, laser biasanya memancarkan sinar dengan panjang gelombang yang lebih pendek daripada partikel yang diinterogasi. Panjang gelombang 488 atau 405 nm adalah umum (1).
Sinar scatter diukur oleh dua detektor optik. Salah satu detektor mengukur scatter sepanjang jalur laser (1). Parameter ini disebut forward scatter (FSC). Detektor lain mengukur scatter pada sudut 90 derajat relatif terhadap laser (1). Parameter ini disebut side scatter (SSC). Ketika diukur bersama-sama, dua parameter ini memungkinkan suatu tingkat pengbedaan sel dalam populasi heterogen.
Pengukuran forward scatter memungkinkan diskriminasi antara sel berdasarkan ukuran. Intensitas FSC sebanding dengan diameter sel, dan hampir sepenuhnya disebabkan oleh difraksi sinar di sekitar sel. Forward scatter terdeteksi oleh photodiode yang mengkonversi sinar menjadi sinyal listrik. Intensitas voltase yang dihasilkan sebanding dengan diameter sel yang diinterogasi (1).
FSC berguna untuk membedakan antara sel-sel sistem imun. Monosit dan limfosit adalah dua kelas darah putih. Umumnya, monosit lebih besar dari limfosit dan menunjukkan forward scatter dengan intensitas lebih tinggi.
Gambar 2. Diskriminasi antara limfosit dan monosit dalam FlowJo berdasarkan parameter scatter. Perlu diingat bahwa contoh ini hanya untuk tujuan ilustrasi, populasi sel yangillustrated tidaklah aktual atau pasien mengalami akut monocytosis.
Pengukuran side scatter memberikan informasi tentang kompleksitas internal sel. Interface antara laser dan struktur intraseluler menyebabkan sinar untuk refleksi atau refraksi. Komponen seluler yang meningkatkan side scatter termasuk granula dan nukleus (1).
Relatif terhadap forward scatter, sinyal-sinyal light dari side scatter lemah. Photomultiplier tube (PMT) digunakan untuk mengukur side scatter karena lebih peka sebagai detektor optik (1).
Side scatter berguna untuk identifikasi sel dengan kompleksitas yang berbeda. Contohnya, monosit dan granulosit. Granulosit dikarakteristikkan oleh volume cytoplasmic yang besar. Refleksi sinar dari granula meningkatkan intensitas ukuran SSC dan memungkinkan pengbedaan antara granulosit dan monosit (1).
Gambar 3. Diskriminasi antara granulosit dan monosit dalam FlowJo berdasarkan parameter scatter.
Untuk setiap sinyal (yaitu impuls elektromagnetik) yang masuk ke detektor (PMT atau photodiode), terdapat tiga karakteristik yang dapat direkam: Height, width, dan area. Sementara penggunaan area pulse paling umum, terdapat kelebihan dan kekurangan masing-masing. Dalam parameter scatter, plot height versus width pulse digunakan untuk mengisolasi sel tunggal yang melewati cytometer, dan dengan demikian menghilangkan sel-sel non-tunggal (doublets, clumps or debris).
Gambar 4. Mengisolasi sel tunggal dari parameter scatter height versus width dalam FlowJo.
FLOW CYTOMETER mengukur FSC dan SSC secara bersamaan, dan dua parameter ini digabung memungkinkan suatu fondasi yang kuat untuk analisis data.