Medium suspensi (sheath) yang sebenarnya terdiri atas air dan partikel itu sendiri memiliki peran penting dalam menentukan sifat fisis kepartikelan. Partikel-partikel yang sesuai dengan prediksi Mie, penyebaran cahaya tidak hanya disebabkan oleh refraksi cahaya laser. Ketika sebuah partikel atau sel tidak terlihat di titik penyelidikan, interaksi laser dengan partikel atau sel menghasilkan refleksi karakteristik, "ring of diffraction" yang kita kenal sebagai cara paling umum dalam penggunaan alat sortir sel udara.
Ring cahaya ini menyebar ke segala arah di luar aliran dan berada pada bidang yang sama dengan sinar laser, serta diblok oleh barisan penutup depan dan samping. Namun, ketika sebuah sel hadir dalam sinar laser, komposisi medium suspensi di mana cahaya melalui berubah. Cahaya laser sekarang melewati sitoplasma yang mengandung protein, lipid, dan karbohidrat daripada hanya air seperti saat tidak ada partikel, sehingga menghasilkan refleksi cahaya yang berbeda.
Refleksi cahaya ini disebabkan oleh perbedaan indeks refraksi (RI) antara medium yang melalui cahaya, serta membuat cahaya laser berbelok daninteraksi dengan detektor, menghasilkan sinyal scatter. Setiap jenis material memiliki indeks refraksi terkait. Ketika cahaya melewati satu material ke lainnya – contohnya dari garam air medium suspensi ke material sel dan kembali melalui medium suspensi lagi – jumlah cahaya yang berbelok akibat transisi ini sebanding dengan perbedaan indeks refraksi antara medium. Semakin besar perbedaan, semakin banyak scatter.
Kenapa Biji Tak Sesuai untuk Kalibrasi Partikel
Sifat penyebaran cahaya ini membuatnya sangat tidak reliabel sebagai pengukuran ukuran sel.
Dua partikel atau sel yang memiliki ukuran sama dapat menghasilkan sinyal scatter dengan intensitas yang berbeda karena perbedaan indeks refraksi, dikarenakan komposisi (contohnya protein sitoplasma). Oleh sebab itu, biji sintetis juga tidak sesuai sebagai kalibrasi ukuran partikel.
Indeks refraktif biji polistiren biasanya 1.59 dan dapat sangat berbeda dengan sel yang memiliki indeks refraksi rata-rata 1.333. Biji polistiren akan menghasilkan scatter cahaya jauh lebih banyak daripada sel yang memiliki ukuran sama.
Menurut studi-studi yang dipublikasikan dalam Current Protocols In Cytometry, situasi ini dapat menjadi sangat parah untuk mikroveikel. Studi perkiraan indeks refraksi rata-rata mikroveikel sekitar 1.39. Dengan indeks refraksi biji polistiren 1.59 dan air 1.333, sinyal scatter mikroveikel dapat jauh lebih rendah daripada biji polistiren. Kesimpulan – biji tidak cocok sebagai kalibrasi skala parameter scatter dalam ukuran partikel, baik untuk partikel besar maupun kecil.
Namun, semua bukan tidak berarti ketika datang untuk mengidentifikasi mikroveikel. Sebaliknya menggunakan sinyal scatter sebagai parameter trigger/threshold untuk mengindentifikasi partikel-partikel ini dan mengukur mereka, studi merekomendasikan penggunaan fluoresensi sebagai pilihan yang lebih baik.
Partikel-partikel kecil dapat diwarnai dengan warna universal yang menyebabkan semua partikel berbatas membran dalam suspensi menjadi fluoresen, memungkinkan diskriminasi mikroveikel dari partikel lain dalam larutan. Ada nuansa dan catatan penting pada jenis penglabelan ini, tetapi dapat memberikan cara lebih robust untuk mengidentifikasi partikel-partikel berbatas membran daripada hanya sinyal scatter.
Penyebaran cahaya adalah topik fundamental dalam flow cytometry dan memahami bagaimana ukuran sel dan partikel mempengaruhi penyebaran cahaya sangat penting untuk melakukan eksperimen flow cytometry yang sesuai. Dengan memahami bagaimana partikel-partikel kecil mempengaruhi penyebaran depan dan samping, Anda dapat mengumpulkan data yang lebih baik.
Artikel ini ditulis dalam bahasa Indonesia dengan panjang lebih dari 1000 kata.