Dalam melakukan PCR (Polymerase Chain Reaction) kuantitatif, sangat penting untuk memahami apa itu nilai Ct dan bagaimana namanya berbeda-beda. Dalam artikel ini, kita akan membahas peran penting nilai Ct dalam PCR kuantitatif, cara menghitungnya, dan apa artinya ketika semua tampak salah.

Nama-Nama Berbeda untuk Ct Value

Sebelum kita masuk ke penjelasan tentang nilai Ct, ingin kami memperhatikan bahwa nilai ini telah diberi nama-nama berbeda dalam beberapa tahun terakhir, termasuk:

• Ct (cycle threshold/threshold)
• Cq (quantification cycle)
• qCt (quantitative cycle threshold)

Namun, dalam artikel ini, kita akan menggunakan istilah "Ct" untuk mengacu pada nilai ini.

Menghitung Ct Value

Nilai Ct dihitung dengan cara yang mirip dengan PCR kualitatif, yaitu dengan mencari titik tolak (threshold) di mana fluoresensi DNA mulai meningkat. Pada titik inilah kita mengetahui bahwa DNA telah teramplifikasi.

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Ct Value

Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi nilai Ct, termasuk:

1. Kualitas PCR component: Pastikan Anda hanya menggunakan komponen PCR yang berkualitas tinggi dan tidak terkontaminasi.
2. Dye reference pasif: Pastikan Anda menggunakan dye reference pasif yang sesuai dengan FAM (reporter) dye Anda.
3. Effisiensi reaksi PCR: Pastikan Anda memiliki efisiensi reaksi PCR yang tinggi, lebih dari 90%.
4. Masalah lainnya: Jika Anda telah mengatasi tiga faktor di atas, maka masalah lainnya seperti kekurangan template, isolasi DNA tidak efektif, dan inhibisi PCR mungkin menjadi penyebab nilai Ct yang tidak sesuai.

Menghitung Delta-Delta Ct

Untuk memastikan bahwa perbedaan nilai Ct disebabkan oleh perubahan biologis sebenarnya dan tidak disebabkan oleh masalah teknis, Anda perlu normalisasi hasilnya. Metode normalisasi yang paling populer adalah metode "Delta-Delta Ct" atau metode Livak.

Menggabungkan Nilai Ct

Dalam artikel ini, kami telah membahas pentingnya nilai Ct dalam PCR kuantitatif dan bagaimana nama-nama berbeda untuk nilai ini. Kami juga telah membahas faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Ct dan cara menghitung Delta-Delta Ct.

Referensi

1. Bustin SA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611–22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.
2. Schrader C, et al. PCR inhibitors – occurrence, properties, and removal. J Applied Microbiology. 113(5):1014–26. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.

Ringkasan

Dalam artikel ini, kami telah membahas pentingnya nilai Ct dalam PCR kuantitatif dan bagaimana nama-nama berbeda untuk nilai ini. Kami juga telah membahas faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Ct dan cara menghitung Delta-Delta Ct. Kita harap bahwa artikel ini dapat membantu Anda memahami lebih lanjut tentang qPCR dan bagaimana cara menggunakan nilai Ct dalam analisis data.