Western Blot adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini mirip dengan western blot, tetapi contoh protein tidak dipisahkan menggunakan elektrophoresis; sebaliknya, protein-spotting dilakukan langsung pada membran atau substrat kertas.

Penggunaan Dot Blot

Koncentrasi protein dalam preparasi kasar (seperti supernatan kultur) dapat diestimasi semi-kualitatif menggunakan metode dot blot jika Anda memiliki protein yang dipurifikasi dan antibodi spesifik terhadapnya. Dalam hal ini, perbandingkan signal dari sampel tidak diketahui dengan signal standar dan perkiraan koncentrasi.

Persiapan dan Teknik Dot Blot

Persiapkan seri dilusi menggunakan contoh peptide yang dibeli secara komersial (dengan kesadaran polipeptida > 90%). Material yang diperlukan:

• Antibodi sesuai untuk dot blot testing
• Contoh peptide yang difosforilasi dan tidak difosforilasi, diketatkan dan tidak diketatkan, atau metilasi dan tidak metilasi
• TBS (Tris-Buffered Saline)

Lakukan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Pilih antibodi sesuai untuk dot blot testing.
2. Ambil contoh peptide yang difosforilasi dan tidak difosforilasi, diketatkan dan tidak diketatkan, atau metilasi dan tidak metilasi.
3. Dilusi peptide ke konsentrasi 100 ng/μL, 5 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 μg/μL, dan 0.01 ng/μL dalam TBS 1x, seperti tabel di bawah ini.

Penggunaan Membran dan Pemindahan Sampel

Di sini, kita akan menjelaskan prosedur untuk dua membran yang paling umum digunakan: nitrocellulose dan polyvinylidene fluoride (PVDF).

Manual Method with Nitrocellulose Membrane

Material yang diperlukan:

• Sample
• Membran nitrocellulose
• Pipette tip

Lakukan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Draw a grid on the membrane with a pencil.
   This is to indicate the region you are going to blot.

2. Load the sample onto the membrane.
   Spot 1 µL of sample onto the nitrocellulose membrane at the center of the grid using a narrow pipette tip.

Blocking and Washing

Material yang diperlukan:

• Preparasi membran
• Blocking buffer (contohnya: 5% milk in TBST atau 2% BSA)
• Wash buffer (TBST: 0.1% Tween-20 in TBS)

Lakukan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Block the membrane for 1 h at room temperature on a shaker.
2. Wash the membrane three times with wash buffer.
   10 min per wash.

Antibody Incubation

Material yang diperlukan:

• Preparasi membran
• Primary antibody
• Secondary antibody (contohnya: ab97051, HRP conjugated)
• Blocking buffer (contohnya: 5% non-fat dry milk (NFDM) atau BSA in TBST)
• Wash buffer (TBST)

Lakukan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Dilute the primary antibody in the blocking buffer.
2. Incubate the membrane in the pre-diluted primary antibody prepared during the previous step.
   Add ~ 10–20 mL of the pre-diluted primary antibody to the membrane.

Incubate for 1 h at room temperature on a shaker.

3. Wash the membrane three times with wash buffer.
   10 min per wash with gentle shaking.

4. Incubate the membrane with secondary antibody.

5. Wash the membrane three times with wash buffer.
   10 min per wash.

Detection

Material yang diperlukan:

• Substrate (contohnya: ECL or chemiluminescent substrate)
• Film or digital camera

Lakukan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Incubate the membrane with substrate.
2. Expose the film or take a photo with digital camera.

Troubleshooting

Jika Anda mengalami masalah dalam prosedur Western Blot, seperti:

• Tidak ada signal yang terlihat
• Signal yang tidak jelas atau terlalu lemah
• Background noise yang terlalu tinggi

Anda dapat mencoba troubleshooting berikut:

• Cek kualitas sample dan antibodi
• Periksa kekuatan signal dengan menggunakan antibody yang lain
• Perbarui teknik blocking dan washing
• Cek penggunaan substrate yang sesuai untuk jenis protein yang Anda analisis

Dengan demikian, Western Blot dapat membantu Anda mengidentifikasi protein secara lebih akurat dan efektif.