Flow cytometry adalah teknologi yang digunakan untuk mengumpulkan dan menganalisis sifat fisik dari populasi sel. Salah satu cara untuk meningkatkan akurasi hasil analisis flow cytometry adalah dengan menggunakan metode Forward versus side scatter (FSC vs SSC) gating. Gating ini berfungsi sebagai filter untuk menentukan apakah suatu sel termasuk dalam population yang diinginkan atau tidak.
Gating FSC vs SSC umum digunakan pada contoh sample darah, namun perlu diingat bahwa scattering forward tidak secara langsung terkait dengan ukuran sel dan scattering side tidak secara langsung terkait dengan kompleksitas sel. Pada beberapa sample, granulocytes (12-17 μm) dapat tampak lebih besar daripada monocytes (20-25 μm). Selain itu, pada sample kecil, level scattering cahaya tidak selalu korelatif dengan ukuran sel.
Meskipun demikian, gating FSC vs SSC tetap berguna untuk mengidentifikasi cell of interest pada sample dengan berbagai jenis sel. Contohnya, Figure 1 menunjukkan bagaimana gating ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis-jenis sel yang berbeda pada darah yang telah diencerkan (red cell lysed whole blood).
Gating FSC vs SSC juga dapat digunakan untuk menghapus debris sebagai mereka cenderung memiliki scattering forward level yang lebih rendah. Mereka biasanya ditemukan pada sudut kiri bawah plot densitas FSC vs SSC (Figure 2).
Saat menggunakan gating, perlu diingat bahwa sel blasting mungkin lebih besar daripada sel istirahat; karena itu, gate yang ketat dapat berarti Anda tidak menemukan populasi yang penting untuk eksperimen Anda. Dalam kasus ini, menggunakan dye viabilitas untuk menghapus debris dan cell mati dapat berguna, serta backgating (dibahas di bawah), untuk mengidentifikasi sel yang jatuh di luar gate. Selain itu, pada beberapa sample seperti darah atau tulang rawan, gating pada SSC vs CD45 atau marker lainnya dapat membantu mengidentifikasi cell yang Anda perlukan.
Secara umum, penting untuk bermain-main dengan data dan memeriksa semua aspek, karena sel Anda mungkin tidak di mana Anda pikirkan.
Menggunakan Gating
Gating FSC vs SSC dapat digunakan untuk mengidentifikasi cell of interest, menghapus debris, dan mendapatkan informasi lebih lanjut tentang populasi sel. Gating ini juga dapat digunakan sebagai filter untuk menentukan apakah suatu sel termasuk dalam population yang diinginkan atau tidak.
Gating Doublet
Doublet cells dapat berpengaruh signifikan terhadap analisis Anda dan dapat mengarahkan pada kesimpulan yang tidak akurat. Gating FSC-H vs FSC-A (Figure 3) dapat digunakan untuk menghapus doublets, serta gating SSC-H vs SSC-A.
Gating untuk Marker Expression
Gating dengan histogram parameter tunggal dapat digunakan untuk mengidentifikasi cell yang mengekspresikan marker tertentu pada population sel tertentu. Contohnya, setelah menggating pada populasi lymphocyte (Figure 1), histogram parameter tunggal CD3 dapat digunakan untuk mengidentifikasi cell CD3-positive (Figure 4). Selain itu, plot ini juga dapat digunakan untuk mudah menghapus cell mati.
Gating dengan Histogram Density Dua Parameter
Gating dengan histogram density dua parameter dapat digunakan untuk menganalisis sample lebih lanjut. Contohnya, setelah menggating pada populasi lymphocyte (Figure 1), plot density dua parameter CD3 vs CD19 (Figure 5) dapat digunakan untuk membedakan T cells dan B cells.
Backgating
Backgating adalah metode yang umum digunakan untuk memastikan pola pengekspresian marker atau metode gating. Ini dapat berguna untuk mendapatkan informasi lebih lanjut untuk mengidentifikasi cell jika Anda tidak yakin dengan gate, tingkat ekspresi, atau apakah cell mati termasuk dalam analisis.
Sekarang Anda Dapat Konfidensialnya Analisis Flow Cytometry
Dengan menggunakan metode gating di atas, sekarang Anda harus dapat mengkonfirmasi analisis flow cytometry dan membuat kesimpulan yang akurat berdasarkan hasil analisis.