Gating dan analisis data adalah salah satu bagian penting dalam analisis FLOW cytometry. Tujuan dari proses ini adalah untuk memisahkan sel-sel yang memiliki karakteristik tertentu dari populasi lainnya, sehingga Anda dapat mengetahui karakteristik dan distribusi populasi sel yang diteliti.
Salah satu metode yang paling umum digunakan dalam gating adalah Forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC). FSC biasanya digunakan untuk menunjukkan ukuran sel, sedangkan SSC menunjukkan kompleksitas atau granularitas sel. Namun, perlu diingat bahwa FSC tidak secara langsung terkait dengan ukuran, dan SSC tidak secara langsung terkait dengan granularitas.
FSC vs SSC gating dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi sel yang berbeda dalam contoh darah yang telah di-lysed. Sebagai contoh, Figure 1 menunjukkan bagaimana FSC vs SSC gating dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi sel yang berbeda dalam darah yang telah di-lysed.
Selain itu, FSC vs SSC gating juga dapat digunakan untuk menghilangkan debris, yaitu partikel-partikel kecil yang tidak memiliki karakteristik sebagai sel. Debris biasanya ditemukan pada sudut bawah kiri plot densitas FSC vs SSC (Figure 2).
Dalam melakukan gating, perlu diingat bahwa cell blasting mungkin lebih besar daripada cell istirahat, sehingga Anda perlu menggunakan gate yang ketat untuk tidak menghilangkan populasi sel yang penting. Dalam beberapa kasus, menggunakan dye viabilitas dapat membantu menghilangkan debris dan cell mati.
Excluding Doublets
Doublet cells dapat mempengaruhi hasil analisis dan menyebabkan kesalahan dalam pengambilan keputusan. Density plot FSC-H (Forward Scatter Height) vs FSC-A (Forward Scatter Area) dapat digunakan untuk menghilangkan doublets, seperti ditunjukkan dalam Figure 3.
Single Parameter Histograms
Histogram parameter tunggal dapat digunakan untuk lebih lanjut mengidentifikasi populasi sel yang memiliki ekspresi marker tertentu. Sebagai contoh, setelah menggating pada lymfosit darah yang telah di-lysed (Figure 1), histogram parameter tunggal CD3 dapat digunakan untuk mengidentifikasi cell CD3-positive (Figure 4).
Two-Parameter Density Plots
Plot densitas dua parameter, di mana masing-masing axisnya menunjukkan marker tertentu, dapat digunakan untuk lebih lanjut analisis data. Sebagai contoh, setelah menggating pada lymfosit darah yang telah di-lysed (Figure 1), plot densitas dua parameter CD3 vs CD19 dapat digunakan untuk membedakan T cell dan B cell (Figure 5).
Backgating
Backgating adalah metode yang umum digunakan untuk mengkonfirmasi pola staining atau metode gating. Hal ini dapat membantu Anda mendapatkan informasi tambahan untuk mengidentifikasi sel jika Anda tidak yakin dengan gate, ekspresi marker, atau apakah cell mati telah termasukkan dalam analisis.
Dengan menggunakan metode-metode tersebut, Anda sekarang harus dapat melakukan analisis FLOW cytometry dengan lebih baik dan membuat kesimpulan yang akurat berdasarkan hasil analisis.